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细菌染色技术 公文汇 www.gongwenhui.com

(2010-11-22 22:29:46) 公文汇 www.gongwenhui.com

目的要求

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初步掌握细菌涂片制作，单染色法及革兰染色法等染色技术。

实验内容

1．细菌染色一般程序

涂片干燥固定 初染 (媒染) 脱色复染

(1) 涂片 临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。

(2)干燥 涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。

(3)固定 细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。

(4) 初染 不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。

(5) 媒染 通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。

(6) 脱色 此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。

(7) 复染 细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。复染液的颜色与初染液有明显不同。

2．常用染料原液配制

一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g～14g；碱性复红3g～7g。

3．常用的染色方法范文TOP100

(1) 单染色法 即用一种染料染色的方法。常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。

1) 染液

① 吕氏美兰液 美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。

② 稀释石炭酸复红液 碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。

2) 菌种 大肠埃希菌普通斜面培养物。

3) 染色方法 于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。

4) 结果 以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。

(2) 革兰染色法

1) 原理 细菌被结晶紫着色后，再经媒染剂处理，染成深紫色或紫黑色。如被酒精脱去颜色，经复红复染成红色，称为革兰阴性菌；如不被酒精脱色，则仍为紫黑色，称为革兰阳性菌。

革兰染色的原理尚未完全明了，主要有三种学说：① 等电点学说 革兰阳性菌的等电点低(pH2～3)，革兰阴性菌等电点较高(pH4～5)，一般染色液pH值

为7.0左右，故电离后阳性菌所带阴电荷比阴性菌多，因此，摄取带阳电荷的染料（如结晶紫）多且不易脱色。② 通透性学说 革兰阳性菌细胞壁的通透性比阴性菌小，脱色剂较易通过革兰阴性菌的细胞壁，将染料溶解洗出，思想汇报专题故易脱色；阳性菌的细胞壁通透性低，故不易脱色。③ 化学学说 革兰阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它能和染料-媒染剂互相结合，使已着色的细菌不易脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐复合物较少，易被脱色。

2) 染液

① 结晶紫染液 取结晶紫饱和溶液20ml+1%草酸铵水溶液80ml混合过滤。② 卢戈碘液 取碘化钾2ml以10ml蒸馏水充分溶解，然后加碘1g待完全溶解后加蒸馏水至300ml。

③ 脱色剂 95%乙醇。

④ 稀释石炭酸复红 同单染色法。

3) 菌种 大肠埃希菌和葡萄球菌混合菌液。

4) 方法

① 初染 将结晶紫染液2～3滴加于制好的涂片上，染色 1min，水洗；② 媒染 加卢氏碘液2～3滴染色1min，水洗；

③ 脱色 95%乙醇脱色0.5min(无紫色脱落为止)，水洗；

④ 复染 加稀释石炭酸复红数滴，染色1min，水洗干后镜检。

5) 结果 革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。

6) 注意事项 ① 涂片不宜过厚，否则脱色受影响，使革兰阴性菌染成革兰阳性菌，造成错误鉴定。② 为防止染液蒸发而改变浓度，碘液的颜色变淡应弃去。③ 涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果，故每次水洗后应将玻片甩干。④ 注意细菌的菌龄，一般以18h～24h左右培养物效果最好，菌龄过长影响细菌染色性。

(3) 萋-纳抗酸染色法(ziehl—neelsen)：主要用于结核杆菌和麻风杆菌检查范文写作。

1) 染液

① 石炭酸复红染液 取碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸水溶液90ml混合。

② 脱色剂 3%盐酸酒精。

③ 复染剂 吕氏美兰染液，同单染色法。

2) 菌种 卡介苗和表皮葡萄球菌混合液。

3) 方法

① 初染 在已固定的涂片上滴加石炭酸复红染液，远火徐徐加热至有蒸汽冒出，但切不可沸腾，并随时添加染色液，染色3 min～5min，冷却后水洗。② 脱色 滴加3%盐酸酒精脱色至无红色流下为止，一般为2min。③ 复染 水洗后用吕氏美兰复染0.5 min～1min，水洗干后镜检。

4) 结果 抗酸菌染成红色，非抗酸菌染成蓝色。

5) 注意事项 ① 加热时火切勿过大，防止染液沸腾。② 每张玻片只允许放一份标本，以免阴阳结果混淆。③ 用过的玻片要彻底洗干净，防止抗酸菌留在玻片上。④ 切勿使用染色缸，印干的滤纸只能一片一张，不得重复使用。⑤ 脱色时间宁长勿短，以免误诊。⑥ 为防止实验室感染，标本要高压灭菌后再制片。

(4) 潘本汉抗酸染色法(panpenhein) 主要用于尿及粪便中抗酸菌检查。

最全面的范文参考写作网站当用萋-纳抗酸染色检出抗酸菌后，用该方法染色，结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌染成蓝色。

1) 染液

① 石炭酸复红染液 见萋-纳抗酸染色法。

② 复染液 取蔷薇色酸1g先溶于100ml无水乙醇中，然后加美兰2g(至饱和)，置室温中4天，使其充分溶解，过滤后加甘油20ml混匀备用。

2) 标本 怀疑肾结核患者的尿液。

3) 方法

① 初染 于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液数滴加温染色2min。② 复染 倾去染液勿水洗，滴加复染液，边滴边倾去，重复4～5次后，水洗、待干、镜检。

3) 结果 结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌及其他细菌染成蓝色。

(5) 鞭毛镀银染色法

1) 染液

① 甲液 鞭酸5g，三氯化铁5g，36%甲醛1ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100ml。② 乙液 取AgNO3 2g溶于100ml蒸馏水中，临用前用15%氨水滴定，出现棕色沉淀后继续滴加氨水直至呈现乳白色薄雾状为止。

2) 方法

网络① 将奇异变形杆菌在1.4%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象。取洁净玻片一张，于玻片上滴加蒸馏水一滴，然后取上述迁徙生长边缘的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，使其自然扩散、干燥，切勿火焰固定。

② 在制好的涂片上滴加甲液染3 min～5min，用蒸馏水冲洗。

③ 用乙液冲去残水后，加乙液0.5 min～1min，并在火焰上方稍加热，用蒸馏水冲洗，干后镜检。

3) 结果 菌体染成深褐色，鞭毛染成浅褐色。

4) 注意事项 ① 细菌培养时传代次数因菌种不同可适当增加。② 制涂片时菌量不宜过多，动作要轻，切勿研磨，以免鞭毛脱落。③ 加乙液后加热温度不要太高。

(6) 魏曦氏鞭毛染色法

1) 染液 饱和钾明矾液2ml，5%石炭酸液5ml，20%鞣酸液2ml相混合。临用时加碱性复红酒精饱和液1ml，混合后过夜，次日过滤后使用。此染液以3日内使用效果最好。

2) 方法 将奇异变形杆菌在1.4%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象。取高度洁净玻片一张，于玻片上滴加蒸馏水一滴，然后取上述迁徙生长边缘的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，使其自然扩散，置37℃培养箱内让其自干。无需火焰固定。滴加染液染0.5 min～1min，水洗待干，镜检。

3) 结果菌体与鞭毛均呈红色。

(7) 芽胞染色法

1) 染液

① 石炭酸复红染液 见抗酸染色法。

② 脱色剂 95%乙醇。

③ 复染液 吕氏美兰染液，同单染色法。

2) 菌种 炭疽芽胞杆菌普通斜面培养物。

3) 方法

① 初染 于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液加热染3 min～5min，勿使染液沸腾。

② 脱色 水洗后用95%乙醇脱色约1min，水洗。

③ 复染 加吕氏美兰染液染1min，水洗干后镜检。

4) 结果 芽胞染成红色，菌体呈蓝色。

(8) 黑斯(Hiss)荚膜染色法

1) 染液 结晶紫染液：取结晶紫饱和液5ml加蒸馏水95ml混合；20%CuSO4水溶液。

2) 标本 提前数日小白鼠腹腔注射肺炎链球菌菌液0.2ml，小鼠死亡后解剖取腹腔液印片。

3) 方法

① 将印片在空气中自然干燥，无需加热固定。

② 滴加结晶紫染液在火焰上加热，使有蒸汽冒出为止，勿水洗。③ 以20% CuSO4溶液冲洗染液，勿水洗，干后镜检。

4) 结果 菌体呈紫色，荚膜呈淡紫色。

(9) 阿尔伯特(Albert)异染颗粒染色法

1) 染液

① 甲液 甲苯胺兰0.15g，孔雀绿0.2g，溶于95%酒精2ml中再加入蒸馏水至100ml及冰醋酸1ml，放置24h后过滤备用。

② 乙液 将碘化钾3g溶于蒸馏水10ml～20ml中，再加碘2g等溶解后加蒸馏水至300ml备用。

2) 菌种 白喉棒状杆菌吕氏鸡蛋斜面培养物。

3) 方法 已固定的涂片上加甲液染3 min～5min，水洗后，再加乙液染色1min，水洗待干，镜检。

4) 结果 菌体呈蓝绿色，异染颗粒呈蓝黑色。

(10) 刚果红染色法(负染色法)：背景着色而菌体不着色的染色方法。

1) 染液 2%刚果红水溶液，1%盐酸酒精溶液。

2) 方法 于载玻片上滴加2%刚果红溶液1滴与少量培养菌混合，涂成均匀厚片待干，以1%盐酸酒精溶液冲洗，待干后镜检。

3) 结果 背景呈蓝色，菌体无色。

(11) 金胺“O”染色法

1) 染液

① 金胺“O”染液 金胺“O”0.1g溶于10ml95%酒精中，另取3ml石炭酸加在87ml的蒸馏水中。将此二液混匀，虽混浊但不必过滤，装入褐色瓶中，放室温保存。

②0.5%盐酸酒精。

③0.5%高锰酸钾溶液。

2) 菌种 怀疑结核的痰标本。

3) 方法 在已固定的涂片上加金胺“O”染液染15min，水洗后用0.5%盐酸酒精脱色2min，水洗，再加0.5%高锰酸钾液作用3min，水洗，待干，用荧光显微镜观察。

4) 结果 抗酸菌呈亮黄色荧光。

（12）美兰染色法

美蓝是常用的活体染色染料，当它处于氧化状态是呈现出蓝色，而还原态时为无色。用它进

行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氢作用，美蓝接受H后就由氧化转变为还原态，故表现出无色；而衰老的细胞由于代谢缓慢或停止，不能使美蓝还原，所以呈蓝色或者淡蓝色。

（13）苏木精-伊红染色

苏木精-伊红染色，又称“苏木素-伊红染色”，或“H&E染色”（hematoxylin and eosin stain、HE stain），是组织学最常用的染色方法之一。

这种染色方法的基础是组织结构对不同染料的结合程度不同。染料苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色，而伊红可以将嗜酸性结构染成粉红色。嗜碱性结构通常包括含有核酸的部分，如核糖体、细胞核及细胞质中富含核糖核酸（RNA）的区域等。嗜酸性结构则通常由细胞内及细胞间的蛋白质，如路易体（Lewy body）、酒精小体（Mallory body）、细胞质的大部分等。有时，黄褐色也会出现在染色样本中，这是由于组织内原有的色素，例如黑色素等造成的。

（14）吉姆萨染液

吉姆萨染液（英语：Giemsa stain）是一种用于染色体的染色方法。它是罗曼诺夫斯基染色法的改进版本。以它的发明者，德国汉堡科学家古斯塔夫·吉姆沙命名。染色物质Giemsa与DNA上的磷酸机团结合，可以用于产生G显带并制作染色体组型图。通过后者，可以观察到染色体变异，如缺失，易位等。

Giemsa在A-T丰富的区段结合率高，通过显微镜可以观察到该区段呈暗带。

（15）免疫组织化学

免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。

免疫组织化学的优势在于专一性、灵敏度、简便快速以及成本低廉，所以广为医院采用，通常是借由特定的肿瘤标记来筛选癌症。免疫组织化学染色法对基础研究及预防和诊疗上都是相当重要的一个方法。

（16）刘氏染色法

刘氏染色法（Liu's stain），一种将动物细胞染色以便用光学显微镜观察的方法。改良自瑞氏染色法（Romanowsky Stain），1953年由台湾大学刘祯辉教授所研究发表。

简介

相较于其他染色法，刘氏染色法的优点是非常快速，染色过程只须2~3分钟。刘氏染色法在临床上的应用非常广泛，主要用作血球染色形态分类，此外也可以当作组织学的简易染色，在临床细菌学上的使用更可以作为阴道分泌物、痰液、脓等检体的简单染色剂(Simple Stain)。成份

刘氏染色法所用的染液分成LiuA和LiuB两部份。LiuA含有Eosin Y，可将细胞质和血红素等染成红色；LiuB则含有Azur I 和methylene azure，可和细胞核以及白血球的嗜碱性颗粒作用，染成蓝紫色。

染液

LiuA Eosin Y 甲醇（用来固定细胞） methylene azure（少量）

LiuB Azur I methylene azure Na2HPO4˙12H2O 水 KH2PO4

步骤

将组织切片放到玻片上风干固定

将Liu A染液滴加在已固定的玻片上，静置30~45秒

直接再加上Liu B染液（大约两倍Liu A体积的量），吹气混合，静置60~90秒

用小水流冲洗玻片背面，洗去残余染液，可看到表面出现绿色金属光泽

篇二：发酵小结

发酵小结

1.生物反应过程的特点

常温常压；原料简单粗放；反应专一性强；反应必须在无菌条件下进行；能够进行复杂高分子化合物的生产；微生物菌种是进行发酵的根本因素；经济效益显著

2.微生物工业对菌种的要求

能在廉价原料制备的培养基上迅速生长和生成所需的代谢产物产量高；培养条件易于控制；生长迅速，发酵周期短；满足代谢控制的要求；抗噬菌体能力强；菌种遗传稳定性好；安全性（不是病源菌，不产毒素）；对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用

3.菌种衰退的原因及保藏方法

一是菌种保藏不当；二是菌种生长的条件没有得到满足，或是遇到不利条件，或是失去某些需要的条件；此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。

斜面低温保藏法：酵母菌

石蜡油封保藏法：酵母菌

砂土管保藏法：细菌，霉菌，防线菌

冷冻干燥法：细菌，防线菌

液氮超低温冻结法：细菌，真菌

4.防止菌种衰退的措施

从菌种选育方法上考虑

1)进行充分的后培养及分离纯化

2)增加突变位点，减少基因回复突变的几率

从菌种保藏方式上考虑

1)尽量减少传代次数

2)选择适宜的保藏培养基

从菌种培养条件上考虑

1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞。

2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失

从菌种管理措施上考虑 :复壮

1）定期对保藏菌种分离纯化，淘汰已退化细胞；

2）定期对发酵液进行分离筛选，选取自发性突变的细胞—生产育种

5.菌种保藏的原理和方法

原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。

一般可通过：保持培养基营养成分在最低水平；缺氧状态；干燥和低温。使菌种处于“休眠’状态，抑制其繁殖能力。

发酵工业用微生物的分离

采样—增殖培养—分离纯化—初筛—复筛—性能鉴定

6.出发菌株的选择

有一定的目标产物的生产能力；生长繁殖快、营养要求低、产孢子多且早；对诱变剂敏感，变异幅度大等；要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞。

7.初筛复筛的区别

初筛以迅速筛出大量的初步要求的分离菌落为目的，以量为主；复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主，复筛结合发酵进行，一株三瓶，可重复多次进行。

8.影响诱变效果的因素

细胞的生长状态（选择对数中后期，同步培养物）；菌悬液的均一性；菌悬液的细胞浓度；菌悬液介质（缓冲液或生理盐水）。

（种子罐的级数主要取决于菌种的性质和菌体生长速率及发酵设备的合理应用！）

（检验液化，是否有淀粉，用碘液，是否呈兰色；检验糖化，是否水解完全：测定还原糖）

9.培养基的配置原则和选择原则

1营养物质满足微生物的需要；营养物质的浓度及配比应恰当；物理化学条件适宜；考虑培养的目的

2应根据微生物的特性和培养的pH的，快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合，发挥各自的优势，避其所短；适当的碳/氮比对发酵的影响极为明显；注意生理酸,碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配。

10.培养基设计步骤

根据前人经验和培养基成分确定必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；通过单因素实验最终确定出适宜的培养基组分；当培养基组分确定后，再确定各组分的最适浓度。

培养基灭菌的要求：达到要求的无菌程度（10-3）；尽量减少营养成分的破坏

11.高温瞬时灭菌的原因

由于灭菌的活化能E比营养物质（维生素）破坏高，因此，随着灭菌温度的升高，比死亡速率的增加较分解速率常数快，因而在较高温度下可以缩短灭菌时间而保留较多的营养物质。

12.连续灭菌与间歇灭菌的比较

连续灭菌的优缺点

优点：保留较多的营养物质质量；容易放大；较易自动控制；缩短灭菌周期；采用板式换热器时，可节约能量；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均匀。

缺点：设备比较复杂，投资较大，易染菌。

分批灭菌的优缺点

优点设备投资较少；染菌的危险性较小；人工操作较方便；对培养基中固体物质含量较多时更为适宜

缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。

（对于小发酵罐，连续灭菌优势不明显；对培养基中含固体颗粒或有较多泡沫时，采用分批灭菌较好。）

13.提高除菌效率的主要措施及影响过滤效率的因素

提高压缩前空气的质量；设计合理的空气预处理设备；设计和安装合理的空气过滤器；降低进入空气过滤器的空气相对湿度。

介质纤维直径越小，效率越高；过滤效率随填充密度和厚度增加而提高；当空气流速低时，过滤效率随气流流速增加而降低，当气流流速增加至临界值后，过滤效率随气流流速的增加而提高。

14.酵母酒精发酵与细胞酒精发酵的异同

相同点：均是厌氧发酵，均产生酒精，从PYR到酒精阶段过程相同

不同点：途径不同，酵母为EMP途径，酒精为ED途径；产能不同，酵母一分子葡萄糖产2分子ATP，酒精只产1分子ATP；细菌酒精发酵代谢速率快，发酵周期短，比酵母菌酒精产率高。

15.同型乳酸发酵与异型乳酸发酵的区别

发酵菌种不同（同型乳酸链球菌，乳酸杆菌等，异型肠膜明串株菌，葡聚糖明串株菌等）；发酵机制不同（同型EMP，异型HPK与PK）；发酵产物也不同（异型除乳酸外还有乙醇乙酸CO2等）。

16．酵母的三种发酵

酵母酒精发酵，亚硫酸盐发甘油发酵，碱法甘油发酵。后两者不产生ATP，产生甘油（碱法还产生乙醇乙酸等）正常酵母菌也有极少量甘油产生：磷酸二羟丙酮也可作为还原辅酶1的氢受体，形成磷酸甘油。

17.谷氨酸的生物合成途径及调节机制

控制生物素亚适量；α-酮戊二酸脱氢酶活力减弱；C02固定反应的酶系强，提高对糖的利用率；增强谷氨酸脱氢酶的活力，并丧失其反馈抑制和反馈阻遏；过量的NH4+

18柠檬酸积累机理

①由锰缺乏抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+浓度升高和一条呼吸活性强的侧系呼吸链不产生ATP，这两方面的因素分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的代谢调节，促进了EMP途径畅通。

②由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。

③在控制Fe2+含量的情况下，顺乌头酸水合酶活性低，从而使柠檬酸积累

④丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和C02固定两个反应平衡，以及柠檬酸(来自: 在 点 网:液体菌种工作总结)合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。

⑤柠檬酸积累增多，pH低，在低pH时，顺乌头酸水合酶和异柠檬脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。

19.氨基酸发酵的代谢控制

控制发酵的环境条件；控制细胞渗透性（通过加表面活性剂或生物素，油酸；加青霉素抑制细胞壁的合成）；控制旁路代谢；降低反馈作用物的浓度（营养缺陷型突变株）；消除终产物的反馈抑制与阻遏作用（抗氨基酸结构类似物突变株）；促进ATP的积累，以利于氨基酸的生物合成

20.核苷酸发酵

在IMP合成系中，IMP脱氢酶收GMP的反馈抑制，也被GMP阻遏；GMP还原酶收ATP的反馈抑制。同样，AMP抑制SAMP合成酶。并且GTP作为SAMP-AMP反应体系的功能体，ＡＴＰ作为ＸＭＰ－ＧＭＰ反应的功能体。

21．分批发酵优缺点

优点：操作简单、周期短；操作引起染菌的概率低;不会产生菌种老化和变异等问题;生产过程，产品质量易掌握。

缺点：非生产时间较长、设备利用率低；高浓度基质抑制产物的形成

补料分批发酵的优缺点

优点：使发酵系统中维持很低的基质浓度；避免快速利用碳源的阻遏效应，防止底物的抑制；能减缓代谢有害物的不利影响；底物浓度过高，粘度影响传质和搅拌；和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题；延长产物的形成期

缺点：存在一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。连续发酵的优缺点

优点：能维持低基质浓度；可以提高设备利用率和单位时间的产量；便于自动控制。

缺点：菌种发生变异的可能性较大；要求严格的无菌条件。

22．影响微生物需氧量的因素

1) 微生物的生理特性（种类和生长阶段）a.好气程度 b.菌龄 c.数量 d.菌的“聚集状态”

2） 培养基特性a.培养基的组成 b.配比和浓度 c.物理性质：粘度，表面张力 d.补料的种类和方式

3）温度：对传氧和生长速率的影响4）其他因素：消泡剂，表面活性剂等

23．发酵不同阶段溶氧的不同

发酵前期由于产酶菌大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降 发酵中期溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等

发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升溶氧下降原因：污染好氧杂菌；菌体代谢发生异常，需氧要求增加；某些设备或工艺条件发生故障或变化。

溶氧上升原因：污染烈性噬菌体；菌体代谢异常，耗氧能力下降；同上。

凡是使KLa和C*增加的因素都能使发酵供氧改善

增加C*的办法

在通气中掺入纯氧或富氧，使氧分压提高；提高罐压（增加溶氧同时也会增加CO2的浓度）；改变通气速率：搅拌和通气；降低温度。

增加KLa的办法

提高设备的供氧能力（从改善搅拌考虑）；增加功率输出（可直接通过改变搅拌器的直径或转速来达到）；增加搅拌（作用在于改善罐内液体的混合和循环，从而具有抑制气泡聚合效果）使液相的良好混合（避免 “死角”的存在）。

（需氧角度：养料的丰富程度影响菌的生长；温度的影响）

24.引起pH下降的因素：碳源过量，C/N比中C过高，特别是葡萄糖过量；中间补糖过多，若溶氧不足，使有机酸大量积累；消泡油添加过量；生理酸性物质的存在。（上升类似）

PH的控制：调节基础培养基的配方（培养基的成分，初始pH，缓冲剂）；补料控制（直接加酸加碱，补加碳源或氮源，如生理酸性物质等）

25.泡沫产生的危害及控制

在好气性发酵中当发酵旺盛时会产生大量泡沫，而引起“逃液”，给发酵造成困难，带来许多负作用：降低发酵罐的装料系数；增加菌群的非均一性；增加污染杂菌的机会；导致产物的损失；消沫剂的加入将给提取工序带来困难

调整培养基成分或改变发酵工艺；机械消沫；消沫剂消沫；从微生物本身的特性着手，防止泡沫的形成。

26.Monod方程应满足的条件

(1)菌体生长处于均衡生长状态(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物(3)假设菌体得率系数恒定(4)反应器内处于全混流状态。

27．质粒的不稳定性表现形式及控制

复制不稳定性 复制时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象

结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失 分配不稳定性 细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失（par基因） 培养环境条件引起的质粒不稳定。

措施：选择合适的宿主菌和载体；选择合适的培养方式；控制合适的发酵培养基和培养条件；采用固定化技术等。

28.不同染菌途径对发酵的影响

种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性

空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐

培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性

设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大

染菌的具体危害：分解产物污染产品，抑制生产菌的生长和代谢的产生，影响产物的提取

29.杂菌的检查方法

a无菌试验:平板划线检查或斜面培养检查,酚红肉汤培养检查(平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确)

b培养液的显微镜拉查:多在染菌程度较深时，用于判断杂菌的种类，靠显微镜无法发现染菌初期的杂菌。(显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌)

c培养液的生化指标变化情况:降糖速度,产酸速度,pH值,溶解氧,光密度,排气中CO2含量,产物含

量,O2的消耗

(其中无菌试验是判断染菌的主要依据)

30.染菌的途径、原因及防治

杂菌侵入的途径在工业上不外乎原料，菌种，空气，设备四个方面。

原料染菌的防治 对于液体原料采用连消方式；对颗粒状淀粉质原料或者小发酵罐，采用实消为好。种子带菌的原因 无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌不彻底；操作不当。防止空气净化系统带菌的主要措施有提高空气进口的空气洁净度；除尽压缩空气中夹带的油和水,保持过滤介质的除菌效率。对于设备的灭菌主要是为了避免“死角”和“渗漏”。

31.发酵下游加工过程的特点

培养液(或发酵液)是复杂的多相系统，从培养液中分离固体很困难。

培养液中所欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高

欲提取的生物物质通常很不稳定

发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定的弹性

32.固定化酶的优缺点及性质、原则

特点：保留活性，可反复和连续使用，酶的运动被物理性限制或位于一特定空间中，但其与催化活性相关的颤动或更为复杂的运动可无障碍的进行。

优点：由于酶被约束或连接在不溶性载体上或载体内，极易将固定化酶与底物、产物分开；下游提取过程容易，减少了酶对产物的污染。产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；固定化酶可回收和反复使用，并使底物的连续供给和产物的移走的连续过程（即较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应）设计成为可能。在大多数情况下，固定化酶能提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以控制；较游离酶更适合多酶反应；可以增加产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。

缺点：固定化过程（共价结合和交联）可能会导致酶的部分失活--酶活力有损失；工厂初始投资大；固定化酶增加了反应过程的成本，主要是固定化载体和试剂的成本；只能用于可溶性底物；胞内酶必须经过酶的分离；不适宜于需要辅酶的反应

酶固定化后，酶性质发生的变化表现在以下几个方面：底物专一性的改；pH-活性曲线和最适pH的变化；稳定性增加；酶被固定化后，其最适作用温度比天然酶高一些，一般因酶而异，大致提高5~15aC；酶活力:一般来说，酶经过固定化后，活力大部分下降。

固定化酶的制备原则：必须注意维持酶的催化活性及专一性；固定化载体必须具有一定的机械强度；固定化酶应该有最小的空间位阻；酶与载体结合牢固；固定化酶应有最大的稳定性；固定化酶成本要低

33.固定化细胞的优缺点

与游离细胞相比 固定化细胞的密度大、可增殖，不需要微生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短发酵生产周期，提高生产能力；细胞可反复或连续使用使用；发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。

与固定化酶相比 可以免除酶的提取和精制，有利于酶活的保持；对外界条件变化敏感性不强，酶在细胞内稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失少，有利于控制反应；若反应体系需要酶和辅因子的再生，固定化细胞是最好的方法；固定化细胞制备的成本比固定化酶低

缺点 仅能利用胞内酶；细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性；可能有副反应

34动物细胞性质及培养的特点

性质：动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。

篇三：2014年助剂学习总结

现在国内的助剂主要分布在有机硅、氟碳、PU三个系列领域。

主要助剂产品介绍：

1.润湿剂

润湿剂能改进颜料粒子对水的可润湿性，有助于保持颜料分散的稳定性。涂料本身含有的大量乳化剂，而润湿剂的加入会进一步增加体系中表面活性剂的含量，这些表面活性剂的存在使得涂料成为非稳定体系，表面张力差极易导致泡沫的产生。因此低泡润湿剂成为首选。

另一份资料称：随着水性、粉末、高固含涂料的发展，作为主要助剂的分散润湿剂也得到很大发展，其中开发研制水性体系中应用的高效超分散剂（高分子分散剂）已成重要课题。已商品化的超分散剂中，聚电解质（如聚羧酸）类超分散剂比例最大，其次是非离子型超分散剂，如：聚氧乙烯衍生物、聚乙烯吡咯烷酮等。近年在市场上应用最广泛的分散剂为：Cognis的Hydropalat 5040/100、SAN Nopco的SN-5027、Ciba的GA-40、长风的P-19等。我国对超分散剂研究较晚，近年也出现一些超分散剂品种，如NBZ-3、PD-5等，但效果不理想，产品也未系列化。

2.消泡剂

传统消泡剂的消泡物质（包括矿物油、蜡、金属皂、有机硅、疏水无机硅等）都属于水不溶性物质，必须加入一定量的乳化剂和扩展剂才能使其快速均匀分散到水性体系中发挥消泡作用。当由于某些原因（如涂装前加水冲稀）导致乳化剂从消泡物质表面脱离后，不溶于水的消泡物质就容易在涂膜表面造成缩孔。

为此出现了分子级消泡剂，这类消泡剂由特殊的矿物油及特殊的分子级消泡物质组成，整个分子呈类似于网状的超分支结构，具有多个锚定点，同时具有一定的自乳化作用，无需另外添加乳化剂，不会出现因乳化剂脱离而造成的缩孔现象。另外，这类消泡剂特殊的结构使其对基材具有一定的润湿作用，可适当减少润湿剂的用量。这种新的消泡结构及消 泡机理将可能引起消泡剂的重大变革，典型产品即：Cognis 的 FoamStar 系列 高黏度体系要想获得完美的消泡效果比较困难，如弹性涂料。这是由于高黏度限制了气泡间液体的流动，气泡的膜壁能够保持一定的厚度，从而气泡难以破裂，导致漆膜出现大量的针孔。针对此种较特殊的场合，各生产商推出了一系列的强力消泡剂。

另一份资料介绍，近年来消泡剂的研究主要集中在有机硅化合物与表面活性剂的复配、聚醚与有机硅的复配、水溶性或油溶性聚醚与含硅聚醚的复配等复配型消泡剂，复配是消泡剂的发展趋势。就目前消泡剂而言，聚醚类与有机硅类消泡剂的性能最为优良。消泡剂要有很好的相容性，具有一定的消泡和抑泡能力，如：科宁的Foamaster

NXZ,Rhodia的681F，BlackBurn的246。

3.增稠流平剂

增稠剂是一种流变助剂，加入后不但能使涂料增稠，同时还能赋予涂料优异的机械及物理化学稳定性，在涂料施工中起到控制流变性的作用。分为无机增稠剂和有机增稠剂。无机增稠剂方面，纳米技术实现无机物颗粒的纳米化。有机增稠剂方面，聚合物类增稠剂的开发依然是主要发展方向，聚合物类型虽然还是以聚氨酯和聚羧酸盐类为主，但通过添加某些物质进行共聚改性、接枝上某些疏水基团等方法，在提高增稠性能的同时，还具有一定的抗水性。另外，为达到低VOC要求，无溶剂增稠剂也逐渐成为关注焦点。有一种增稠剂通常主要在某种剪切速率下能显著提高体系粘度，在其他剪切速率下则不太明显。近年来，增稠剂以开发聚羧酸盐类产品为主要发展方向，提高聚丙烯酸增稠剂的应用性能，如储存稳定性、耐电介质性能和增稠能力等。除此之外，性能良好的半合

成增稠剂、聚氨酯类增稠剂也得到不断发展。国内开发的增稠剂多是阴离子型，非离子型很少，阳离子型未见报道。

目前应用最多的增稠剂品种有水合型，如纤维素类： Clariant 的 H 30000 YP2，碱溶涨型，如KNP 的Thicklevelling HASE 系列。

但缔合型增稠剂的使用也日益增加，这类产品主要是聚氨酯和聚醚类，其分子链能够与乳液粒子和颜、填料缔合。当施加剪切力时，这种缔合结构被破坏，使得涂料易于施工，而一旦去除剪切力，则颜、填料和乳液粒子通过增稠剂又重新缔合在一起，黏度恢复，使得涂料体系得以保持稳定。此类产品有：Cognis 的 DSX 3116 / 3075 /3551，Rohm &Haas 的 Acrysol RM-2020NPR / RM-8W、Ashland 的 DrewThix 864。

4.工程漆用助剂

俗话说：三分涂料七分施工，大量的事实表明，很多所谓的涂料问题是由不合格的施工所致，而非涂料本身的质量问题。施工包括环境、基材、工艺等所有从施工到结束的各个阶段，但我国的实际情况是基材环境不控制，处理不当，操作不规范。针对这一情况。KNP推出了专门针对施工的工程漆助剂：Conspirit 180/220/310/775，在涂料施工之前添加，已解决施工过程中及施工完成后漆膜出现的缩孔、浮色等各种弊病。

5.成膜助剂

成膜助剂是水性涂料中VOC的主要来源，又称聚结助剂，能促进乳液粒子的塑性流动和弹性变形，改善其聚结性能，能在广泛的施工范围内成膜。成膜助剂通常是挥发很慢的溶剂，如各类醇醚、醇醚醋酸酯和醇酯等。

减少成膜助剂对涂料VOC的影响，有以下几种方案：

A.改进乳液自身成膜性，减少成膜助剂的用量，但对TG较高的树脂，成膜性能差，此

方法不合适。

B.控制成膜助剂的原材料及产品本身性质。

C.改变成膜助剂的挥发行为，传统成膜助剂在最后阶段完全逸出，二挥发速率较慢的

成膜助剂在较长时间内仍保留在涂膜中，使涂膜不能完全硬化，耐水性及耐化学性下降。而改进的成膜助剂能够被乳胶微粒吸收而留在漆膜中，减少挥发量。

5.杀菌剂

率先进入中国市场，最具代表性的是罗门哈斯的Kathon LXE。这一高性能防腐杀菌剂的主要活性成分是氯甲基异噻唑啉酮，且不含甲醛。

以前的杀菌剂主要是甲醛类，环境危害性比较大。现在比较环保的产品，国内比较有代表性的有：陕西石油化工研究院的华科-981、华科-108，上海轻工业研究所的JX-515等，在华北和华东市场占有一席之地。未来建筑涂料杀菌剂发展的一个重要方向是利用纳米技术。现在国内外的防腐、防霉剂大多是有机化合物，对人体和环境或多或少都有一定副作用。纳米TiO2\ZnO等纳米材料对人体无毒，抗菌范围广、热稳定性优良。纳米材料的作用机理是基于光催化反应使有机物分解而起抗菌作用，在日光照射及空气和水的存在下，生成原子氧和氢氧自由基，能够与细菌内的有机物反应，生成二氧化碳和水，具有防霉和抗菌综合作用。如将纳米抗菌粉于涂料中可广泛用于室内墙面、医院、食品车间等。国外已开始开发银抗菌纳米材料，这种较为有效的抗菌材料在一定的银离子浓度下即可有效杀灭微生物。我国也有采用银系、银-锌系及银-铜系、银-锌-铜系无机抗菌粉添加于丙烯酸涂料中制得抗菌涂料的研发报道，抗菌效果优良且经济。

6.多功能化助剂

市场上综合性能最好的多功能助剂是陶氏的AMP-95，AMP-95不仅可以提高颜料润湿、分散、涂料的流动和流平，还赋予乳胶漆优异的PH值稳定性。

7.特殊功能助剂

A.负离子添加剂：主要是主要为经过后处理的天然矿物粉体，如：奇冰石、电气石、神州奇石、麦饭石、桂阳石等。在涂料成膜后，空气中的水分子可以通过高分子膜的空隙与涂料中的负离子添加剂碰撞，在负离子粉体颗粒电极附近的强电场作用下电离成氢氧根离子和氢离子。氢氧根离子进入空气，吸引空气中水分子，形成水合羟基离子（H3O2-），即为空气负离子，从而增加空气中负离子的浓度，达到改善环境的目的。

另外负离子添加剂持续释放的H3O2-负离子能够中和和包覆在游离出的带有正电荷的甲醛、氨、苯等有害气体颗粒的周围，使其形成大粒子沉降到地面。还可除去空气中的异味，因为H3O2-能中和空气中的氧自由基及氧化性气体（腐败异味），负离子添加剂产生的电厂可以使有机物异味在电厂中分解，从而对空气产生净化作用。

同时还具有抗菌抑菌效果。但与防腐杀菌剂不同。后者是保护涂膜不熟细菌微生物侵蚀，而负离子添加剂则对周围环境进行杀菌和抑菌。负离子对包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌在内的许多菌种有消除和抑制作用，这同样是利用H3O2-包覆中和作用，使菌种失去增生与繁殖的条件。

负离子添加剂已在涂料中有相当应用，但在负离子释放性能上还有待进一步提高，目前所采用的主要手段是用稀土元素对负离子添加剂进行活化。

B.纳米添加剂：纳米材料具有表面效应、小尺寸效应、光学效应、量子尺寸效应、宏观量子尺寸效应等特殊性质，可以使涂料获得新的功能。如粒度进入纳米尺度，材料表面活性中心的增多可提高其化学催化和光催化的反应能力，在紫外线和氧的作用下给予涂层自清洁能力；表面活性中心与成膜物质的官能团可发生次化学键结合，大大增加涂层的刚性和强度，从而改进涂层的耐划伤性；经过表面经过改性的纳米材料用于内外墙涂料可以获得同时憎水和憎油的特性，显著提高涂层的耐污性并可提高耐候性；某些粒径小于 100 nm 的纳米材料对α、γ射线具有吸收和散射作用，可提高涂层防辐射的能力，在内外墙涂料中起到防氡气的作用；将纳米材料用在底漆中，可以增加底漆和基材的附着力，提高机械强度、且纳米级的颜料与底漆的强作用力及填充效果有助于改进底漆与涂层的截面结合；纳米材料在面漆中可起到表面填充和光洁作用，提高面漆的光泽，减少阻力。纳米二氧化硅添加到外墙涂料中可提高涂料的耐擦洗性，纳米碳酸钙可提高聚氨酯硬度等等。（纳米添加剂——杀菌功能、自洁功能）目前纳米材料在涂料中应用仍处于初级阶段，主要集中在隔热涂料，抗菌涂料、界面涂料、大气净化涂料等。国内较成熟的集中在改善建筑外墙涂料的耐候性和内墙涂料的抗菌性方面。

纳米技术的关键技术如：解决纳米微粒容易团聚而造成分散困难，传统涂料的研究方法及检验方法不完全适用，施工方法有待改进等。

8.耐水型助剂

胶体改性剂：乳液和颜、填料是乳胶漆的主要成分，乳液为疏水性，而无机颜、填料为亲水性，疏水的乳液和亲水的颜、填料难以在一个体系中稳定的存在，由此而导致颜、填料的絮凝和涂料的分水、分层等现象。因此，分散剂、增稠剂等被应用在涂料的制备过程中，以获得颜、填料的良好分散及稳定悬浮，从而改善涂料的储存稳定性。

然而，在高颜料体积浓度乳胶漆中，分散剂的使用并不能完全消除颜、填料粒子的聚集。传统的阴离子型羧酸盐类分散剂主要是以提高颜、填料粒子的表面电位，利用双电层原理使颜、填料粒子得以在水中分散。但羧酸盐类分散剂与颜、填料粒子表面电荷相同，因此

分散剂与颜、填料粒子间的吸附很弱，分散剂很容易从颜、填料表面脱离，从而引起弱絮凝。基于此，胶体改性的理念得以提出，这里的胶体泛指无机颜、填料的分散体。通过对胶体的改性，在颜、填料表面增加高分子缔合点，提高了分散剂在颜、填料粒子表面的吸附力，分散剂的作用从而得以更加有效的发挥。高分子缔合点的增加使得颜、填料表面更加疏水，因而与乳液间的相容性也得到了显著的改善。目前市场上的胶体改性剂只有 KNP 的 Colloid Modifier 134。

9.催干剂

催干剂的作用是加速漆膜的氧化、聚合、干燥，达到快干的目的。传统的钴锰锌钙等有机酸皂催干剂品种繁多，但各有缺点。近年开发的稀土催干剂，较好解决上述问题。但也只能部分取代价昂物稀的钴催干剂。最近出现的一种完全不用钴、不含铅、可单独使用的新型复合催干剂。

异辛酸锆催干剂是近年开发的一种新型催干剂，它能有效替代异辛酸铅催干剂。锆催干剂是一种配位型催干剂，能与连接料中的羟基或其它极性基团络合，生成更大分子量的配位络合物。锆催干剂具有铅催干剂的底催干性，因而在许多催干体系中取代铅催干剂的作用。同时它色泽浅，无毒。

10.固化剂

涂料用助剂分类：

一．流动和分散控制助剂（包含触变剂、表面活性剂、防浮剂、PH值调节剂等）

触变剂：增稠剂、抗流挂剂、抗沉降剂或悬浮剂、抗凝胶剂、流平剂、成膜助剂、边缘润湿促进剂、防止火山口缺陷助剂、增塑剂。

表面活性剂：润湿剂和填料分散剂、抑泡剂和消泡剂、其他表面活性剂。

防浮剂

PH值调节剂

二．反应性助剂（促干剂、固化催化剂和促进剂、光引发剂、增粘剂）

三．与环境老化有关的助剂（提高性能助剂、与温度变化有关的助剂、菌类控制剂） 提高性能助剂：抗结皮和抗氧化剂、光稳定剂、疏水剂、防腐蚀助剂、表面润滑控制

剂、抗静电剂。

与温度变化有关的助剂：抗冻融剂、热稳定剂、阻燃剂、膨胀剂。

菌类控制剂：杀菌剂（罐内防腐、涂膜防菌）、防污剂、其他。

四．特殊效果促进剂（表面状态控制助剂、光学效果添加剂、气味控制剂）

表面状态控制助剂：光泽控制剂（增光剂、消光剂）、特殊纹理效果添加剂 光学效果添加剂：荧光剂、增亮剂、特殊效果填料（如珠光云母）、液晶

气味控制剂：特殊气味添加剂、除味剂。

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